2019年，川源與嘉興同(tong)濟(ji)環境研(yan)究院(yuan)成立(li)了微生物(wu)技(ji)術(shu)研(yan)發(fa)中心，致力于藍(lan)綠藻毒素及種群豐富度實時快速監測(ce)手段的研(yan)發(fa)。

藍藻(zao)又稱藍綠(lv)藻(zao)、藍細菌，是最(zui)原始、最(zui)古(gu)老的藻(zao)類植物之一(yi)。由于藍藻(zao)對高溫(wen)、低光強和紫(zi)外線均(jun)有適(shi)應性(xing)，同時(shi)可以過量攝取無(wu)機碳和營(ying)養(yang)物質，受氮、磷等(deng)元素污(wu)染后易大面(mian)積爆發引起水(shui)體富營(ying)養(yang)化(hua)。

藍藻能產(chan)生(sheng)各種(zhong)天然毒(du)(du)(du)素(su)，主要是環肽、生(sheng)物堿(jian)和脂多(duo)糖內毒(du)(du)(du)素(su)，致(zhi)毒(du)(du)(du)類型包括肝毒(du)(du)(du)性，神經毒(du)(du)(du)性，細胞毒(du)(du)(du)性，遺傳毒(du)(du)(du)性，皮炎(yan)毒(du)(du)(du)性等。

實(shi)驗室采(cai)用酶聯免疫(yi)吸附測定(ding)（ELISA）和熒光(guang)定(ding)量聚合酶鏈式反應（qPCR）分(fen)別對樣品中所含目(mu)標毒素(su)及(ji)物種豐富度進行檢(jian)測。

為了獲(huo)取(qu)更(geng)直接的(de)(de)數(shu)據，公司改裝了一(yi)臺可直接進入現(xian)場(chang)實時檢測的(de)(de)“移(yi)動式(shi)監測車”，“移(yi)動式(shi)監測車”還原了實驗室的(de)(de)基本布局，裝有qpcr潔凈操作臺、存儲冰箱、耐酸堿實驗桌面、防火地板、水槽(cao)及(ji)回收水水槽(cao)等。實驗桌上裝有可調節大小的(de)(de)固定條用(yong)于固定ELISA酶(mei)標儀和qCPR儀等設備。

“移(yi)動式監測車”可(ke)實(shi)現：

?更及時(shi)地在(zai)采(cai)樣(yang)完成后對樣(yang)品(pin)進(jin)行預處理以及檢測，使(shi)檢測數據更具時(shi)效性。

?避免了長途采樣時，樣品儲存長時間對(dui)檢(jian)測結果的(de)影響(xiang)。

?減少(shao)運送時間、減少(shao)外部(bu)微生物(wu)影響及水樣中微生物(wu)降解的(de)狀況。

?提供更直(zhi)接、更準(zhun)確(que)的環境(jing)檢測報告。

藍(lan)綠(lv)藻實時(shi)快(kuai)速(su)監測的重要意義

1. 對水體(ti)中(zhong)藍(lan)綠藻生長及毒性情況進行(xing)實時快速(su)高效的(de)監(jian)測并實現對藍(lan)綠藻水華爆發的(de)快速(su)預警。

2. 預(yu)(yu)測各(ge)水體(ti)潛(qian)在的(de)(de)藍(lan)綠(lv)藻水華爆發程度(du)及毒性程度(du)，為有關部(bu)門實施藍(lan)綠(lv)藻水華爆發的(de)(de)監測和(he)預(yu)(yu)防提供具體(ti)的(de)(de)信息和(he)方向。

3. 對飲用(yong)水(shui)、娛樂(le)用(yong)水(shui)等進行準(zhun)確(que)快速的(de)監(jian)測，杜絕微生物及(ji)毒(du)素帶來的(de)危(wei)害，確(que)保用(yong)水(shui)安全。

4. 推(tui)動ELISA和qPCR技(ji)術在環(huan)境(jing)監(jian)測(ce)方面的(de)運用，一定程(cheng)度上彌補傳統(tong)監(jian)測(ce)手段的(de)不足。

延伸閱讀：藍綠藻(zao)實時(shi)快速監(jian)測方(fang)法

?酶聯免疫(yi)吸附測定（ELISA）

ELISA方法的(de)(de)基本(ben)原(yuan)理是(shi)酶(mei)分子(zi)與(yu)(yu)抗(kang)(kang)體(ti)或抗(kang)(kang)體(ti)分子(zi)共價結(jie)合(he)，此(ci)種結(jie)合(he)不(bu)會改(gai)變(bian)抗(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)免(mian)疫學(xue)(xue)特(te)性(xing)，也不(bu)影響酶(mei)的(de)(de)生物(wu)學(xue)(xue)活性(xing)。此(ci)種酶(mei)標記抗(kang)(kang)體(ti)可(ke)與(yu)(yu)吸附(fu)在固相(xiang)載體(ti)上的(de)(de)抗(kang)(kang)原(yuan)或抗(kang)(kang)體(ti)發生特(te)異(yi)性(xing)結(jie)合(he)。滴(di)加底(di)物(wu)溶液(ye)后，底(di)物(wu)可(ke)在酶(mei)作用(yong)下使其所含的(de)(de)供氫(qing)體(ti)由無色的(de)(de)還原(yuan)型變(bian)成有色的(de)(de)氧化型，出現顏色反應(ying)(ying)(ying)(ying)。因此(ci)，可(ke)通過底(di)物(wu)的(de)(de)顏色反應(ying)(ying)(ying)(ying)來判定有無相(xiang)應(ying)(ying)(ying)(ying)的(de)(de)免(mian)疫反應(ying)(ying)(ying)(ying)，顏色反應(ying)(ying)(ying)(ying)的(de)(de)深淺與(yu)(yu)標本(ben)中相(xiang)應(ying)(ying)(ying)(ying)抗(kang)(kang)體(ti)或抗(kang)(kang)原(yuan)的(de)(de)量呈正比。此(ci)種顯色反應(ying)(ying)(ying)(ying)可(ke)通過ELISA檢測(ce)儀(yi)進行定量測(ce)定，這(zhe)樣就將酶(mei)化學(xue)(xue)反應(ying)(ying)(ying)(ying)的(de)(de)敏感性(xing)和抗(kang)(kang)原(yuan)抗(kang)(kang)體(ti)反應(ying)(ying)(ying)(ying)的(de)(de)特(te)異(yi)性(xing)結(jie)合(he)起來，使ELISA方法成為(wei)一種既特(te)異(yi)又敏感的(de)(de)檢測(ce)方法。

川源-同(tong)濟微生物技術研發中心運(yun)用上述ELISA方法，針對藍藻爆發水體中常見的(de)三種藻毒素(su)(su)：微囊藻毒素(su)(su)、擬柱(zhu)孢藻毒素(su)(su)和(he)蛤蚌毒素(su)(su)開發了合(he)理高(gao)效(xiao)快(kuai)速(su)的(de)檢(jian)測方法及流程，能夠(gou)在1至2小時內完(wan)成對待測樣品(pin)中毒素(su)(su)濃度的(de)檢(jian)測。

?熒(ying)光定(ding)量聚合酶(mei)鏈式反應(ying)（qPCR）-Taq-Man探針法(fa)

實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是(shi)一種在DNA擴增(zeng)反應中(zhong)(zhong)，以熒光(guang)化學物質測(ce)每次聚合酶鏈式反應（PCR）循(xun)環后產物總量(liang)的(de)方(fang)法。通過內參(can)或者外參(can)法對待測(ce)樣品中(zhong)(zhong)的(de)特(te)定DNA序列進行定量(liang)分析(xi)的(de)方(fang)法。qPCR是(shi)在PCR擴增(zeng)過程中(zhong)(zhong)，通過熒光(guang)信號(hao)，對PCR進程進行實時(shi)檢測(ce)。由于(yu)在PCR擴增(zeng)的(de)指數時(shi)期，模(mo)(mo)板的(de)Ct值和該模(mo)(mo)板的(de)起始拷(kao)貝(bei)數存在線性關系(xi)，所以成為定量(liang)的(de)依據。

實(shi)時熒光定量(liang)(liang)PCR分(fen)為：SYBRGreen法(fa)和(he)TaqMan探針(zhen)法(fa)兩類。本實(shi)驗室運用(yong)TaqMan探針(zhen)法(fa)，目前所(suo)有的探針(zhen)法(fa)qPCR的理論(lun)基礎都是利用(yong)了(le)熒光共振(zhen)能量(liang)(liang)轉(zhuan)移(yi)現象，探針(zhen)上存在一對能產生(sheng)熒光共振(zhen)能量(liang)(liang)轉(zhuan)移(yi)的基團(tuan)，利用(yong)PCR反(fan)應(ying)中(zhong)的一些(xie)過程（酶(mei)切，雜交等），使兩個基團(tuan)的距離產生(sheng)變化，使系(xi)統中(zhong)的熒光強度或者熒光種類發生(sheng)變化，這種變化又與PCR產物的種類和(he)量(liang)(liang)有直接關系(xi)，通過檢(jian)測這種變化，我們(men)就(jiu)可(ke)以檢(jian)測出(chu)PCR反(fan)應(ying)體系(xi)中(zhong)產物的種類和(he)量(liang)(liang)。

本實驗室所(suo)用的(de)(de)(de)(de)Taq-Man探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)法(fa)是最經(jing)典的(de)(de)(de)(de)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)方(fang)法(fa)，設計一條與擴(kuo)增產(chan)物能互補雜(za)交的(de)(de)(de)(de)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)，在探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)的(de)(de)(de)(de)5’端(duan)(duan)(duan)標(biao)記熒(ying)光(guang)(guang)基(ji)團(tuan)(tuan)（供體(ti)），在探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)3’端(duan)(duan)(duan)標(biao)記淬(cui)滅基(ji)團(tuan)(tuan)（受體(ti)），當探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)完整時(shi)(shi)，熒(ying)光(guang)(guang)基(ji)團(tuan)(tuan)和淬(cui)滅基(ji)團(tuan)(tuan)距離(li)(li)很近（探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)長(chang)度）因熒(ying)光(guang)(guang)共(gong)振能量轉移，熒(ying)光(guang)(guang)基(ji)團(tuan)(tuan)在入射光(guang)(guang)激發(fa)下(xia)不發(fa)出熒(ying)光(guang)(guang)。PCR反應(ying)進行時(shi)(shi)，探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)雜(za)交在擴(kuo)增產(chan)物上(shang)，當引物介導的(de)(de)(de)(de)延伸反應(ying)到(dao)達探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)位置時(shi)(shi)，因taq酶擁(yong)有5’-3’的(de)(de)(de)(de)外切酶活性(xing)，會從5‘端(duan)(duan)(duan)切割（水解）探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)，從而使(shi)(shi)5’端(duan)(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)基(ji)團(tuan)(tuan)和3’端(duan)(duan)(duan)的(de)(de)(de)(de)淬(cui)滅基(ji)團(tuan)(tuan)分離(li)(li)，使(shi)(shi)它(ta)們的(de)(de)(de)(de)間距超過(guo)10nm，超出熒(ying)光(guang)(guang)共(gong)振能量轉移的(de)(de)(de)(de)范圍(wei)，熒(ying)光(guang)(guang)基(ji)團(tuan)(tuan)此時(shi)(shi)在合(he)適入射光(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)作(zuo)用下(xia)，就能發(fa)出自身(shen)波長(chang)的(de)(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)。探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)雜(za)交是特異性(xing)的(de)(de)(de)(de)，所(suo)以熒(ying)光(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)種類和量能特異性(xing)的(de)(de)(de)(de)代表目標(biao)產(chan)物的(de)(de)(de)(de)種類和量。

川源-同濟(ji)微(wei)生物(wu)技(ji)術(shu)研發(fa)中(zhong)(zhong)(zhong)心(xin)采用(yong)針對(dui)(dui)(dui)產毒(du)(du)微(wei)囊藻特有的(de)(de)毒(du)(du)素合(he)成(cheng)酶(mei)基因(yin)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)mcyB基因(yin)設計(ji)的(de)(de)引(yin)物(wu)，并運用(yong)Taq-Man探針法對(dui)(dui)(dui)樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)mcyB基因(yin)進行定(ding)量(liang)分析。此方法能(neng)夠在(zai)1小(xiao)時內完成(cheng)對(dui)(dui)(dui)待測(ce)樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)產毒(du)(du)微(wei)囊藻含量(liang)的(de)(de)檢(jian)測(ce)。